Como Funciona El Microscopio Electrónico?

Haz de electrones y capacidad de resolución

La microscopía se define como el conjunto de técnicas y métodos destinados a hacer visibles los objetos de estudio que, por su pequeñez, no son accesibles para el ojo humano. Para ello, se usa el microscopio. El primero que se inventó fue el óptico, que contiene dos o más lentes y que permiten obtener una imagen aumentada del objeto, el cual funciona por refracción. Sin embargo, presenta la limitación de que no se puede obtener una magnificación más allá de mil aumentos. Por eso, en el siglo XX, se inventó el microscopio electrónico, mucho más potente.

El microscopio electrónico utiliza electrones con alta energía para realizar observaciones a diferencia del óptico, que se sirve de la luz (fotones). Electron microscopes (EMs) function like their optical counterparts except that they use a focused beam of electrons instead of photons to "image" the specimen and gain information as to its structure and composition.

• Los microscopios electrónicos tienen longitudes de onda muy cortas en comparación con el microscopio óptico, lo que permite una mejor potencia de resolución.
• El microscopio electrónico puede resolver características que son más de 1 millón de veces más pequeñas.
• El microscopio electrónico, al utilizar electrones con alta energía, permite pasar de observaciones con una magnificación promedio de 2.000 aumentos a otra mayor de 300.000.
• El microscopio electrónico posibilita también obtener una mayor profundidad de campo, lo que permite conseguir un efecto más real de las tres dimensiones.

Componentes principales

En general, un microscopio electrónico moderno tiene varios componentes clave: la fuente de electrones, las lentes electromagnéticas y uno o más detectores de electrones. El microscopio comienza generando un haz concentrado de electrones desde la fuente, que es canalizado por las lentes hacia la muestra. Una vez que los electrones del haz interactúan con la muestra, se reflejan o la atraviesan, si es lo suficientemente fina. El detector se coloca para capturar estos electrones reflejados o transmitidos, que transportan diversos detalles sobre la muestra debido a su interacción.

Fuente de electrones

Existen varios tipos de fuentes de electrones, clasificadas a grandes rasgos como fuentes termoiónicas o de emisión de campo. Las fuentes termoiónicas calientan un filamento o cristal utilizando una corriente aplicada hasta que hay suficiente energía para emitir electrones. Las fuentes de emisión de campo aplican un fuerte campo electrostático a una punta metálica afilada (tungsteno), y la concentración de energía en el borde de la punta provoca la eyección de electrones. La elección de una fuente termoiónica frente a una de emisión de campo depende en gran medida del coste y de la calidad de imagen necesaria.

Lentes electromagnéticas

Al igual que las lentes de cristal enfocan y dirigen la luz en un microscopio óptico, las lentes electromagnéticas controlan el flujo de electrones a través del microscopio. Una lente electromagnética consta de una serie de bobinas eléctricas paralelas que producen un campo magnético. Éstas están conectadas a piezas polares, cilindros metálicos huecos que enfocan el campo magnético cerca del haz de electrones. Los electrones son atraídos por el campo a través del centro de la pieza polar.

Detector de electrones

Originalmente, los electrones se detectaban haciéndolos interactuar directamente con la película de la cámara, que responde de forma similar tanto a los electrones como a los fotones. Hoy en día, la mayoría de los microscopios electrónicos utilizan en su lugar una cámara digital, ya sea con un centelleador que emite luz o con un detector directo de electrones. La resolución se interpreta por píxel del detector, y algunos detectores alcanzan los 4k x 4k píxeles físicos (o 16 millones de píxeles en total).

Longitud de onda y energía

La energía que se maneja en estos sistemas esta representada por una unidad denominada electronvoltio (símbolo eV). Un electronvoltio se define como una unidad de energía para el electrón cuando es acelerado por una diferencia de potencial de un voltio. Este valor se obtiene experimentalmente y equivale aproximadamente a 1,602176462 x 10-19 julios.

Un microscopio electrónico de barrido convencional puede alcanzar del orden de 30 keV (1 keV = 103 eV). En 1924, el físico francés Luis de Broglie pudo comprobar como un haz electrónico acelerado a una determinada velocidad posee una longitud de onda determinada.

1. Cuanto mayor sea esa velocidad de aceleración de los electrones, menor es la longitud de onda.
2. Por lo tanto, el poder de resolución mayor.
3. El ojo humano puede ver hasta 0,1 milímetros.
4. El microscopio óptico, hasta 0,0002 milímetros.
5. El electrónico de barrido, hasta más o menos 40 nanómetros.
6. Un nanómetro equivale a 1/1.000.000 milímetros.

Desde la aparición de la microscopía electrónica en la década de 1930, esta revolucionaria tecnología nos ha permitido captar progresivamente información a escala micro, nanométrica e incluso atómica, superando las limitaciones de la microscopía óptica y revelando la maquinaria oculta que subyace a toda la materia.

Microscopio electrónico de transmisión y barrido

Hoy en día hay dos tipos principales de microscopios electrónicos utilizados en entornos de investigación clínica y biomédica: el microscopio electrónico de transmisión (TEM) y el microscopio electrónico de barrido (SEM); a veces, el TEM y el SEM se combinan en un solo instrumento, el microscopio electrónico de transmisión de barrido (STEM).

• TEM: magnifica de 50 a ~50 millones de veces; la muestra parece plana.
• SEM: magnifica de 5 a ~500.000 veces; imágenes nítidas de las características superficiales.
• STEM: magnifica de 5 a ~50 millones de veces; la muestra parece plana.

En el TEM, los electrones procedentes del cañón de electrones pasan a través de una lente condensadora antes de encontrar la muestra, cerca de la lente objetivo. La mayor parte de la ampliación se consigue mediante el sistema de lentes objetivo. La imagen se visualiza a través de una ventana situada en la base de la columna y se fotografía utilizando película o, más recientemente, una cámara CCD, elevando la pantalla fluorescente de visualización con bisagras.

El microscopio electrónico de barrido, mejor conocido por sus siglas en inglés como SEM (scanning electron microscope), es un tipo de microscopio electrónico, diseñado para estudiar directamente las superficies de objetos sólidos, que utiliza un haz de electrones enfocados con energía relativamente baja como una sonda de electrones que se escanea de manera regular sobre la muestra.

Señales producidas en la muestra

La acción del haz de electrones estimula la emisión de electrones dispersados de alta energía y electrones secundarios de baja energía de la superficie de la muestra. El microscopio electrónico de barrido utiliza electrones emitidos y funciona según el principio de la aplicación de energía cinética para producir señales sobre la interacción de los electrones.

Electrones secundarios y retrodispersados

Los electrones secundarios y retrodispersados se utilizan para producir una imagen y a su vez desempeñan el papel principal de detectar la morfología y la topografía de la muestra.

Electrones retrodispersados

Los electrones retrodispersados muestran contraste en la composición de los elementos de la muestra.

Rayos X

A veces se detectan rayos X y se utilizan para mostrar los elementos atómicos dentro de las muestras. Esto puede ser muy útil para analizar el contenido elemental celular o subcelular de los tejidos.

Imágenes tomográficas

Se pueden obtener imágenes tomográficas (tridimensionales o 3-D) inclinando y/o girando la muestra mientras se adquiere una imagen. Los recientes avances en el corte de secciones muy finas de tejidos y la obtención de imágenes de la cara del bloque de tejido han permitido obtener imágenes 3D subcelulares de alta resolución.

Gracias a lo estrecho del haz de electrones, las micrografías con SEM cuentan con una gran profundidad de campo que brinda una apariencia 3D, la cual permite comprender perfectamente la estructura de la superficie de la muestra. En el mundo de lo más pequeño, no existe el color con la longitud de onda electrónica y, por lo tanto, las imágenes aparecen en blanco y negro.

Recorrido del haz en el SEM

En el SEM, los electrones del cañón de electrones se enfocan hasta un punto fino en la superficie de la muestra por medio del sistema de lentes. Este punto se escanea a través de la muestra bajo el control de las corrientes en las bobinas de escaneo situadas dentro de la lente final. Los electrones secundarios de bajo voltaje se emiten desde la superficie de la muestra y son atraídos hacia el detector. El detector transmite señales a una consola electrónica y la imagen aparece en una pantalla de computadora.

1. Un haz de electrones se mueve en un patrón X-Y a través de una muestra conductora.
2. La muestra libera varias señales de datos que contienen información estructural y de composición.
3. Debido a que se utilizan electrones como fuente de radiación en lugar de fotones de luz, se mejora la resolución.
4. Debido a que la muestra se irradia en un modo de secuencia temporal, se logra una gran profundidad de campo y las imágenes aparecen en tres dimensiones.
5. Una amplia gama de aumentos (10 a 30 000×) facilita la correlación de imágenes macro y microscópicas.

La preparación de las muestras es relativamente fácil ya que la mayoría de los equipos SEM sólo requieren que estas sean conductoras. Es decir la muestra generalmente debe estar recubierta con una capa de carbón o una capa delgada de un metal como el oro para brindarle las propiedades conductoras que necesita la muestra; para después realizar el barrido correspondiente con los electrones acelerados.

Control de imágenes y datos

La naturaleza de los microscopios electrónicos modernos requiere la gestión a través de un ordenador externo que ejecute un software de control. Lo ideal es que éste coordine y supervise la fuente, las lentes y los detectores para optimizar la obtención de imágenes y datos. Algunos software de control integrados pueden incluso ofrecer automatización, lo que permite recopilar una gran cantidad de datos de forma desatendida.

• Los microscopios electrónicos modernos pueden visualizar claramente filas y columnas de átomos discretos en materiales cristalinos.
• Pueden reproducir estructuras tridimensionales de proteínas hasta las moléculas de agua individuales coordinadas.
• Estos detalles han permitido innumerables avances en la ciencia de los materiales y la biología, entre otros campos.
• Han contribuido a nuestra comprensión de los fenómenos a macroescala con conocimientos moleculares y atomísticos.

Los TEM y SEM equipados con detectores de rayos X se denominan microscopios electrónicos analíticos (AEM); los análisis que utilizan estos instrumentos se describen mediante varios términos, por ejemplo, microanálisis de rayos X con sonda electrónica (EPMA o EPXMA) o análisis de rayos X de dispersión de energía (EDX).