Como Teñir Muestra Microscopio?

La preparación de la muestra para el microscopio es un paso esencial para llevar a cabo una observación exitosa. El proceso adecuado de preparación depende siempre de la muestra y debe tener en cuenta el tipo de detalles que se quieren observar. Para poder observar un grupo de bacterias, normalmente se prepara una muestra en un porta que será colocado en el microscopio. La preparación de la muestra empieza por la fijación de la muestra al porta y termina con la coloración de los organismos.

Cuando hablamos de tinción celular, nos referimos a aquella forma de diagnóstico de enfermedades infecciosas empleadas en un laboratorio. Aunque existen múltiples tinciones, todas ellas son realmente útiles para caracterizar y conocer nuevas especies y para detectar agentes infecciosos tales como parásitos, bacterias u hongos. Los microorganismos son demasiado pequeños para ser contemplados a simple vista; con tal de conocer sus estructuras, tamaños o composiciones es necesario un estudio bajo microscopio. Para ello resulta mucho más sencillo tratar los microorganismos con colorantes o tintes, lo que facilita su observación.

¿Cuándo es necesario teñir una muestra?

No vas a necesitar tintes para ver la mayoría de los microorganismos, como rotíferos, tardígrados, paramecios, etc. Los tintes usualmente se usan para las laminillas secas, para ver estructuras celulares y bacterias. Las manchas solo sirven para ver tejidos y bacterias. Para todas esas criaturas que se ven habitualmente en microscopía aficionada, solo se necesita un poco de agua.

En entornos clínicos, los microscopios de luz son los microscopios más utilizados. Existen dos tipos básicos de preparación que se utilizan para ver especímenes con un microscopio óptico:

• Monturas húmedas: el espécimen se coloca sobre el portaobjetos en una gota de líquido. Algunos especímenes, como una gota de orina, ya están en forma líquida y pueden depositarse sobre el portaobjetos usando un gotero. Las muestras sólidas, como un raspado de la piel, se pueden colocar en el portaobjetos antes de agregar una gota de líquido. En ocasiones el líquido utilizado es simplemente agua, pero a menudo se agregan manchas para mejorar el contraste. Una vez que se ha agregado el líquido al portaobjetos, se coloca un cubreobjetos encima y el espécimen está listo para su examen.
• Especímenes fijos: la "fijación" de una muestra se refiere al proceso de unir celdas a un portaobjetos. La fijación a menudo se logra ya sea calentando (fijación por calor) o tratando químicamente el espécimen. Además de unir el espécimen al portaobjetos, la fijación también mata los microorganismos en el espécimen, deteniendo su movimiento y metabolismo al tiempo que preserva la integridad de sus componentes celulares para su observación.

Tipos de fijación

Fijación por calor

Se utiliza de forma rutinaria para observar procariotas. Normalmente una película de células (un frotis) se calienta suavemente pasando el portaobjetos por una llama. La fijación por calor preserva la morfología global pero no las ultraestructuras. Para fijar con calor una muestra, una capa delgada de la muestra se extiende sobre el portaobjetos, y luego el portaobjetos se calienta brevemente sobre una fuente de calor.

Fijación química

Se utiliza para proteger las subestructuras celulares finas y la morfología de los microorganismos más grandes. Los fijadores químicos penetran en la célula y reaccionan con los componentes celulares, normalmente se unen a proteínas y lípidos para inactivarlos, insolubilizarlos e inmovilizarlos. Las mezclas comunes de fijadores contienen sustancias como etanol, ácido acético, cloruro de mercurio, formaldehído y glutaraldehído.

Colorantes y características de los tintes

Los numerosos tipos de colorantes utilizados para teñir microorganismos tienen dos características en común: contienen grupos cromóforos, grupos con dobles enlaces conjugados que dan al colorante su color, y pueden unirse a las células por medio de enlaces iónicos covalentes o hidrófobos.

Las manchas, o tintes, contienen sales compuestas por un ion positivo y un ion negativo. Dependiendo del tipo de colorante, el ion positivo o el negativo puede ser el cromóforo (el ion coloreado); el otro ion no coloreado se llama contraión. Si el cromóforo es el ion cargado positivamente, la tinción se clasifica como colorante básico; si el ion negativo es el cromóforo, la tinción se considera un tinte ácido.

• Tinción positiva: un tinte que será absorbido por las células u organismos que se estén observando, agregando color a los objetos de interés para que destaquen sobre el fondo. Los tintes básicos comúnmente utilizados como fucsina básica, violeta cristal, verde malaquita, azul de metileno y safranina típicamente sirven como manchas positivas.
• Tinción negativa: absorbida por el fondo pero no por las células u organismos en el espécimen. La tinción negativa produce un contorno o silueta de los organismos sobre un fondo colorido. Los cromóforos cargados negativamente en los tintes ácidos son repelidos por las paredes celulares cargadas negativamente. Los tintes ácidos comúnmente utilizados incluyen fucsina ácida, eosina y rosa de bengala.

Conseguir los colorantes que se usan comúnmente para las tinciones de microscopía en el laboratorio puede ser caro. Se pueden probar alternativas como tintes para madera, tintes para el pelo, tintes para tela, tintas, etc., que son más fáciles de conseguir y mucho menos caros. También el azul de metileno y el verde malaquita se usan a menudo como desinfectantes para acuarios.

Tinciones simples y diferenciales

Las tinciones pueden clasificarse en dos grandes grupos:

• Tinción simple: se caracteriza por el uso de un solo colorante. De este modo, toda la muestra se tiñe de un solo color, conociéndose así la morfología celular del microorganismo en cuestión. Una simple tinción generalmente hará que todos los organismos en una muestra parezcan ser del mismo color, incluso si la muestra contiene más de un tipo de organismo.
• Tinción diferencial: emplea más de un colorante, poniendo de manifiesto las diferencias entre las células o entre partes de la misma. En otras palabras, dos organismos en una muestra teñida diferencialmente pueden parecer de diferentes colores.

Las técnicas de tinción diferencial comúnmente utilizadas en entornos clínicos incluyen tinción de Gram, tinción ácido-resistente, tinción de endoesporas, tinción de flagelos y tinción de cápsulas. Los colorantes más empleados en este campo son la safranina y cristal violeta, entre otros, que se combinan con componentes celulares como ácidos nucleicos o polisacáridos ácidos.

Tinción de Gram

El procedimiento de tinción de Gram es un procedimiento de tinción diferencial que implica múltiples etapas. Fue desarrollado por el microbiólogo danés Hans Christian Gram en 1884 como un método eficaz para distinguir entre bacterias con diferentes tipos de paredes celulares, e incluso hoy en día sigue siendo una de las técnicas de tinción más utilizadas. La tinción de Gram se utiliza en el campo de la microbiología desde hace más de un siglo.

1. Se aplica violeta cristal, una tinción primaria, a un frotis fijado por calor, dando a todas las células un color púrpura.
2. A continuación, se agrega yodo de Gram, un mordiente. El yodo de Gram actúa como un agente de captura que se compleja con el violeta cristal, haciendo que el complejo de violeta cristal—yodo se agrupe y permanezca contenido en gruesas capas de peptidoglicano en las paredes celulares.
3. Se agrega un agente decolorante, generalmente etanol o una solución de acetona/etanol. Las células que tienen capas gruesas de peptidoglicano en sus paredes celulares generalmente retienen el tinte violeta cristalino y permanecen moradas. El agente decolorante lava más fácilmente el colorante de las células con capas de peptidoglicano más delgadas, haciéndolas nuevamente incoloras.
4. Finalmente, se agrega una contratinción secundaria, generalmente safranina. Esto tiñe las células decoloradas de rosa y es menos perceptible en las células que aún contienen el tinte violeta cristal.

Las células teñidas de púrpura, cristal-violeta se denominan células grampositivas, mientras que las células rojas teñidas con safranina son gramnegativas. Las bacterias gramnegativas tienden a ser más resistentes a ciertos antibióticos que las bacterias grampositivas. La tinción de Gram puede ayudar a los médicos a clasificar los patógenos bacterianos en una muestra en categorías asociadas con propiedades específicas, lo que permite determinar qué antibiótico es el adecuado.

Otras tinciones diferenciales de uso común

Tinción ácido-resistente

Es capaz de diferenciar dos tipos de células grampositivas: las que tienen ácidos micólicos cerosos en sus paredes celulares, y las que no. Dos métodos diferentes son la técnica de Ziehl-Neelsen y la técnica de Kinyoun. Ambos usan carbolfucsina como mancha primaria. Las células cerosas y ácido-resistentes retienen la carbolfucsina incluso después de aplicar un agente decolorante (una solución ácido-alcohol). Luego se aplica una contratinción secundaria, azul de metileno, que vuelve azules las células no ácido-resistentes. La diferencia fundamental entre los dos métodos es si se usa calor durante el proceso de tinción primaria: el método Ziehl-Neelsen utiliza calor, mientras que el método Kinyoun no.

Tinción de cápsulas

Ciertas bacterias y levaduras tienen una estructura externa protectora llamada cápsula. Las cápsulas no absorben la mayoría de los colorantes básicos; por lo tanto, se suele utilizar una técnica de tinción negativa para la tinción de las cápsulas. El tinte tiñe el fondo pero no penetra en las cápsulas, las cuales aparecen como halos alrededor de los bordes de la célula. El espécimen no necesita ser fijado por calor antes de la tinción negativa. Una técnica común es agregar unas gotas de tinta india o nigrosina a un espécimen.

Tinción de endoesporas

Las endosporas son estructuras producidas dentro de ciertas células bacterianas que les permiten sobrevivir a condiciones duras. La tinción de Gram por sí sola no puede usarse para visualizar las endoesporas. El método de Schaeffer-Fulton utiliza calor para empujar la tinción primaria (verde de malaquita) hacia la endospora. El lavado con agua decolora la célula, pero la endospora retiene la mancha verde. A continuación, la célula se contratiñe de color rosa con safranina.

Tinción de flagelos

Los flagelos son estructuras celulares similares a la cola utilizadas para la locomoción por algunas bacterias, arqueas y eucariotas. Debido a que son tan delgados, los flagelos normalmente no se pueden ver bajo un microscopio óptico sin una técnica especializada. La tinción de flagelos engrosa los flagelos aplicando primero mordiente (generalmente ácido tánico, pero a veces alumbre potásico), que recubre los flagelos; luego el espécimen se tiñe con pararosanilina o fucsina básica.

Técnica de montaje húmedo con colorante

Para los observadores que deseen añadir colorante a muestras en montaje húmedo, la técnica es sencilla: se prepara un montaje húmedo, se pone una gota de tinte al lado del cubreobjetos, se usa papel de cocina en el lado opuesto del cubreobjetos, y a medida que el agua se drena, jala el tinte debajo del cubreobjetos y hacia la muestra. Se hace lo mismo con una gota de agua después de uno o dos minutos para limpiar el exceso de tinte y luego se observa.

La mayoría de colorantes se utilizan para teñir directamente el objeto de interés, pero algunos colorantes como la tinta china y la nigrosina se utilizan en tinciones negativas, en las que lo que se tiñe no es la célula sino el fondo; las células aparecen como objetos brillantes en un fondo oscuro. El pH puede modificar la eficacia de tinción de estos colorantes, ya que la naturaleza y cantidad de cargas en los componentes celulares varía con el pH.

Para las laminillas secas, lo mejor sería comprar laminillas ya preparadas, ya que son un poco más avanzadas y tal vez no valga la pena el gasto y la lata de teñirlas. Un microscopio vale la pena especialmente para las laminillas húmedas; una vez que se adquiere experiencia en eso, se pueden comprar los tintes después, si se desea.